L'IMPACT DES NEUROSCIENCES SUR LES THÉRAPIES

Les neurosciences sont à l'origine de beaucoup d'espoirs et de fantasmes. Grâce à quelques exemples on peut démythifier ce qui est présenté dans les journaux, ce que tout le monde pense, les attentes des patients…Une vision plus réaliste sera présentée grâce à une connaissance du système nerveux, des ses troubles, de quelques modes exploratoires ainsi que des possibilités de traitements.

Transcription de la 526 e conférence de l'Université de tous les savoirs donnée le 23 janvier 2004

Yves Agid « L'impact des neurosciences sur les thérapies »
L'Europe comporte 400 millions d'individus, dont 17 % ont plus de 65 ans, et représente la population la plus touchée par les maladies neurodégénératives, telles que les maladies de Parkinson ou d'Alzheimer. Il existe beaucoup d'autres pathologies neurologiques, telles que les accidents vasculaires cérébraux (AVC), l'épilepsie ou la sclérose en plaque. Ces maladies posent des problèmes de santé publique, mais aussi des problèmes socio-économiques. La maladie d'Alzheimer, qui concerne cinq millions de personnes en Europe, entraîne une dépendance totale trois à cinq ans après le début de la maladie et un coût d'environ 80 milliards d'euros par an. Au total, ces maladies neurologiques sont fréquentes, et coûtent plus de 300 milliards d'euros par an à la communauté européenne, ce qui peut paraître énorme, mais qui représente cependant moins que le coût des problèmes psychiatriques. Des dizaines de millions de personnes endurent des dépressions, des angoisses, 4 millions souffrent de psychoses (schizophrénie, délires,...). Les traumatisés de la route représentent quant à eux 1,7 million de nouveaux patients chaque année en Europe. Que peut faire la médecine pour soulager tous ces patients sur le plan neurologique ?

La première chose que le médecin apporte à son patient tient à la relation particulière qu'ils entretiennent ensemble. Tout bon médecin est un psychothérapeute qui s'ignore. Si la psychiatrie, la psychologie ou la neuropsychologie, sont des sciences très importantes dans la vie courante, elles le sont encore plus en médecine. Il y a d'ailleurs une analogie entre la psychothérapie et l'effet placebo (du latin je plairai). Cet effet existe dans tout médicament. Le placebo est une substance inerte administrée pour son effet psychologique. Il n'a, de manière remarquable, d'effet que lorsque le patient et le médecin ont une confiance parfaite dans son action. On dit que 40 % des médicaments prescrits dans en France sont d'ailleurs des placebo. Une expérience très classique illustre cet effet. Des étudiants en médecine reçoivent un comprimé parmi deux, l'un présenté comme sédatif et l'autre comme stimulant, mais ne contenant en réalité qu'une substance inactive. Plus des deux tiers des étudiants ayant reçu le « sédatif » ont déclaré avoir sommeil, et ceux ayant pris deux comprimés avaient plus envie de dormir que ceux qui n'en avaient pris qu'un. Un tiers de l'ensemble du groupe a signalé des effets secondaires, tels des maux de têtes, un picotement des extrémités, ou une démarche titubante. Trois étudiants seulement sur 56 n'ont ressenti aucun effet ! Cela prouve que l'acte médical, le fait de donner un médicament, n'a de sens que dans un contexte médecin/malade, ce que les médecins, parfois débordés, mais aussi les patients, ont tendance à oublier. Une relation médecin/patient de qualité est une chose absolument fondamentale.
Il y a encore une trentaine d'années, le cerveau était vu comme une boite noire, dans laquelle personne ne pouvait ni ne voulait regarder. Nous verrons que le cerveau est en effet une structure extraordinairement complexe. On commence cependant aujourd'hui à comprendre ce qui se passe dans un cerveau, normal ou anormal. Cette connaissance pourrait nous permettre d'agir de manière sélective sur les dysfonctionnements du cerveau malade.

Le cerveau humain pèse en moyenne 1350 g (celui de Lord Byron pesait 2,3 kg, et celui d'Anatole France, supposément le plus grand QI ayant jamais existé avec Voltaire, 900 g). Le cerveau est formé de deux hémisphères, chacun divisé par convention en quatre lobes, qui tirent leur nom des os du crâne qu'ils recouvrent : les lobes frontal, pariétal, temporal et occipital. Le cerveau humain est constitué de 100 milliards de cellules nerveuses. Chaque neurone présente des branches (des axones et des dendrites) qui ont chacune à leur extrémité des petites spicules sur laquelle sont établis en moyenne 10 000 contacts avec les cellules voisines. Le cerveau est donc un véritable réticulum. Chaque cellule nerveuse émet environ 1000 signaux par seconde. Par conséquent 1018 signaux sont véhiculés dans le cerveau chaque seconde, soit un milliard de milliard de signaux ! Vu de l'intérieur, le cerveau se présente comme une couche de cellules périphériques (le cortex cérébral) d'où des faisceaux de cellules nerveuses envoient des prolongements (projettent) vers les structures profondes du cerveau, que l'on appelle les noyaux gris centraux, ou les ganglions de la base. Différentes zones fonctionnelles ont été identifiées dans le cerveau : celle qui permet d'accomplir un acte moteur, la partie associative qui sous tend la fonction intellectuelle et le cortex dit limbique, qui contrôle les émotions. Chaque zone projette de manière spécifique vers la zone correspondante dans les structures profondes. Ces régions ne sont cependant pas cloisonnées : comment expliquer une fonction aussi extraordinaire que l'émotion déclenchée en voyant un tableau de Botticelli ?
Une cellule nerveuse peut mesurer un mètre de long : c'est le cas de cellules dont le noyau se trouvent dans la moelle, et l'extrémité de l'axone dans un orteil par exemple. Dans le cerveau, un neurone se trouvant dans une structure et projetant dans une autre émet aussi au cours de son trajet d'autres prolongements vers d'autres structures. Ce n'est pas un vecteur qui transmet une seule information à une cible unique : il reçoit des milliers d'afférences, et distribue son information électrique à une multitude d'endroits différents. L'arborescence des prolongements des neurones est d'une grande complexité, et les lois qui régissent l'établissement de ces réseaux ne sont pas encore parfaitement comprises. Les extrémités des prolongements des neurones contactent d'autres cellules nerveuses et présentent un métabolisme cellulaire extrêmement compliqué : des milliers ou dizaines de milliers de voies de transduction de signaux différentes, des récepteurs par milliers modulé par des neuromédiateurs. La vision que nous avons de ces mécanismes n'est encore que fragmentaire.
Il réside donc un hiatus entre la connaissance que nous avons du cerveau dans son ensemble et au niveau cellulaire alors que tout est relié physiologiquement. Si on veut imaginer des traitements futurs pour le malade, il faut comprendre comment il fonctionne, c'est à dire quelles sont les lois physiologiques qui vont permettre à l'information d'être émise et reçue. Comment des paroles, lorsqu'elles arrivent au cerveau, sont-elles intégrées, mémorisées, et provoquent-elles une réponse, que nous en ayons conscience ou non ? Les bases cellulaires de la mémoire, du langage et du subconscient commencent à être décortiquées et nous allons notamment voir des exemples illustrant notre compréhension de mécanismes contrôlant des phénomènes d'une part moteurs et d'autre part psychologiques.

Que se passe-t-il dans notre cerveau lorsque l'on bouge le pouce ? Il faut avoir l'idée de le faire, sélectionner le programme moteur (qui implique en fait tous les muscles de l'organisme car lorsque le bras est levé, le corps entier est mobilisé, ce qui est fait de manière subconsciente), le préparer à partir et exécuter le mouvement. C'est donc un problème sensori-moteur très cognitif. La neuro-imagerie, notamment l'IRM, permet de commencer à élucider ces étapes, en repérant les zones activées par une action. Les ganglions de la base s'allument ainsi lors de la préparation du mouvement. Lors de l'exécution, d'autres zones sont activées, et les ganglions de la base s'éteignent. Tout se passe très rapidement : 30 ms sont nécessaires pour qu'un signal aille de la moelle au pouce. Même si les échelles de temps sont beaucoup plus grandes que dans le domaine informatique (0,0003 ms pour la transmission d'un signal), l'homme parle et pense très vite.
Si un mouvement comme celui-ci est contrôlé, il peut aussi arriver que des pathologies entraînent des mouvements involontaires : les dyskinésies. Si tous les circuits qui permettent de réaliser ce mouvement sont connus, il doit être possible d'agir sur l'étape qui fonctionne mal. Dans certains cas les médicaments peuvent supprimer des symptômes, mais un médicament prescrit pour une petite défaillance à un endroit donné du cerveau diffuse dans tout le cerveau, ce qui provoque des effets secondaires. Un patient atteint de la maladie de Parkinson est gêné dans ses déplacements, il est très lent. Lorsqu'il est traité par de la dopamine, l'absence de mouvement fait place à la frénésie, l'hyperkinésie. Pour éviter ces complications, il est aussi possible d'aller directement à l'endroit défectueux. Pour ce faire, des électrodes stimulantes reliées à une pile, un pacemaker placé sous la clavicule, sont implantées dans une structure très profonde du cerveau, large de quelques millimètres (le noyau subthalamique). Le traitement de malades de Parkinson par cette technique pointue leur a permis de retrouver des mouvements normaux. Malheureusement cette technique ne permet de soulager que 5 % des cas de maladie de Parkinson, mais elle représente un énorme progrès scientifique : grâce à la connaissance parfaite de la physiopathologie, c'est-à-dire des bases neuronales des circuits altérés, et de ce pourquoi ils sont non fonctionnels, la vie de patients a été transformée.

La connaissance avance aussi dans le domaine du traitement par le cerveau des mécanismes émotionnels, notamment grâce à l'étude de patients présentant des pathologies atypiques. Prenons l'exemple d'un homme de 45 ans, opéré à deux reprises pour une grosse tumeur du cerveau. Quelques temps après l'opération, ce patient a commencé à collectionner les télévisions dans sa cave, sa chambre, sa salle de bain et jusque dans les tuyaux d'aération de son appartement. Cet homme était pourtant normal, malgré une légère apathie : son QI était tout à fait usuel et il vivait en famille. L'IRM a en fait montré une lésion très limitée des deux cotés du cortex limbique, dans une zone jouxtant l'ancienne place de la tumeur, expliquant ainsi ses troubles psychiques. Il existe des malades psychiatriques qui ont des lésions organiques du cerveau.

Ces cinq dernières années de nombreuses études non pathologiques ont été menées. Des patients sains sont placés dans des situations provoquant une émotion simple, et une IRM est réalisée pour observer les zones du cerveau qui s'activent. Lors d'une expérience, les témoins sont confrontés à deux photos d'une personne attrayante, la seule différence entre les deux images étant le fait que le sujet de l'image semble regarder le témoin ou non. Cela provoque donc une émotion élémentaire. Les régions du cerveau allumées dans le premier et le second cas sont soustraites. La seule zone activée uniquement dans le second cas est une petite structure se trouvant avec d'autres à la base du cerveau, l'ensemble contrôlant les émotions : le striatum ventral. Ces structures existent aussi chez les reptiles, et jouent un rôle dans les activités automatiques motrices, psychiques, et intellectuelles. De la même manière qu'il existe des structures nous permettant d'avoir une activité motrice inconsciente (on peut parler tout en conduisant), nous avons un inconscient psychique. Il est intéressant de noter que ces structures très anciennes s'activent pour une émotion aussi subtile.
De la même façon, des expériences ont été menées sur des singes avec une électrode implantée dans une unique cellule du cortex préfrontal. Ces singes apprennent à réaliser une action pour recevoir une récompense. L'enregistrement du neurone permet d'évaluer si ce neurone est actif ou non. Si la tâche est complexifiée et oblige le singe à effectuer un raisonnement abstrait, cette cellule nerveuse s'active de manière spécifique. Ce neurone encode donc des règles abstraites. La compréhension du cerveau dans ses grandes fonctions commence aussi à se faire à l'échelle cellulaire.
Une cartographie assez précise des circuits de cellules nerveuses activés et des fonctions aussi complexes que ce que l'on vient de décrire peut ainsi être réalisée. C'est très simplificateur dans la mesure où l'allumage de ces structures ne signifie pas forcément qu'elles sont un centre intégrateur.

Les malades présentant des désordres psychologiques dramatiques sont pour le moment traités avec des médicaments (anti-dépresseurs, anxiolytiques, neuroleptiques) mais cela représente une véritable camisole chimique. Chez des patients présentant un dysfonctionnement de l'attraction ou de la récompense (comme chez les toxicomanes, les pédophiles), on peut imaginer repérer les circuits de cellules participant à ces grandes fonctions intellectuelles et ici émotionnelles, affectives, pour trouver un médicament avec une action très sélective sur le circuit cérébral défectueux. Sans revenir au désastre de la psychochirurgie, on pourrait transposer ce qui a été fait sur les malades de Parkinson, c'est-à-dire l'utilisation d'une technique réversible, qui ne donne pas d'effet secondaire et qui est adaptable. Le développement d'une neurochirurgie du comportement, qui est actuellement du domaine de la recherche, peut se concevoir, dans des cas d'extrêmes sévérités et dans des conditions éthiques et juridiques réglementées. Il pourrait être possible par exemple de modifier de manière sélective des circuits de neurones pour soulager les patients.

Quelles disciplines sont mises en Suvre pour soulager les patients ? La neurophysiologie permet de comprendre le fonctionnement ou le dysfonctionnement des réseaux nerveux. Des préparations in vitro, des tranches de cerveau contenant quelques millions de neurones constituent des modèles simplificateurs. Des techniques très performantes sont mises en Suvre pour comprendre, par exemple, le phénomène épileptique et trouver des médicaments. Il faut cependant tenir compte du fait que les réseaux de neurones ne sont pas rigides comme un câblage informatique, mais peuvent se reconfigurer. Ce sont des assemblages plastiques, où les cellules repoussent et établissent de nouveaux contacts, contrairement à ce que l'on croyait dans le temps. Chaque cellule a de plus une mémoire personnelle. Il faut tirer profit de toutes ces propriétés pour essayer de soulager les malades avec des thérapeutiques adaptées pour chacune des cellules. D'autres disciplines telles que les neurosciences cognitives, la robotisation, l'informatique, la modélisation, la psychologie, l'anthropologie, la sociologie, la neuropsychologie et bien d'autres ont énormément à apporter au patient, et c'est un drame qu'existe un tel hiatus entre la faculté des lettres et celle des sciences. Des programmes de recherche en commun sont nécessaires. Les neurosciences cognitives tirent profit de l'avantage de l'homme par rapport aux modèles cellulaires ou animaux, du fait qu'il peut s'exprimer, ce qui procure des informations précieuses sur le vécu des individus et leur souffrance. La neuro-imagerie permet en outre de mesurer le volume du cerveau de certaines structures, leur fonction, d'étudier leur anatomie, voire leur chimie par spectro-IRM. La sémiologie (l'étude des signes cliniques de la maladie) est une science moins connue, mais apporte énormément, et permet de faire des diagnostics et de trouver des thérapeutiques originales.
Nous venons de montrer comment progresse notre compréhension du fonctionnement du cerveau à l'échelle des comportements, de son organisation et de son anatomie. Dans quelle mesure cela permet-il de trouver des médicaments ou des thérapies pour soulager les symptômes des malades, guérir, prévenir ou réparer ?
A l'heure actuelle, des vaccins, préviennent certaines maladies mais pas celles du cerveau. Les seuls outils disponibles pour guérir les maladies sont les antibiotiques. En outre, la chirurgie permet de réparer les fractures, et de retirer les tumeurs. Néanmoins, la médecine actuelle ne sait arrêter l'évolution ni du diabète, ni de l'arthérosclérose, ni d'aucune maladie neurodégénérative, même s'il est possible de soulager certains symptômes.

La neurodégenérescence est le résultat de deux phénomènes : une mort cellulaire d'une part sélective (des neurones dopaminergiques dans le cas de la maladie de Parkinson) et d'autre part lente, mais plus rapide que le viellissement normal d'une cellule. Une cellule peut mourir de deux manières : quand un tissu est brûlé, ou quand un abcès se forme, les cellules qui le composent meurent par nécrose, mais, dans les cas naturels, la cellule se suicide pour mourir, elle entre en apoptose. La plupart de nos neurones vivent toute notre vie, les cellules nerveuses ne meurent que très peu. Cependant leurs capacités diminuent. Dans la substance noire des patients atteints de Parkinson se trouvent trois types de neurones : des neurones sains vieillissants, quelques neurones en apoptose qui meurent en quelques jours et surtout des neurones malades, en état d'affaiblissement pathologique, qui meurent en quelques mois. En tant que pharmacologue, quel mécanisme analyser pour combattre pour arrêter l'évolution de la maladie ? Le vieillissement normal, l'apoptose, la mort pathologique ? Un grand nombre d'équipes travaillent sur l'apoptose, qui ne concerne pourtant qu'une petite partie de la mort cellulaire dans cette maladie.

La biologie moléculaire à notre disposition permet d'identifier et de comprendre le rôle des gènes qui codent les protéines, à la base de la vie cellulaire, et de leurs mutations. L'avancement actuel des connaissances montre cependant que le même gène peut être responsable de différentes maladies, et une même pathologie peut être causée par différents gènes. Il existe par exemple une maladie génétique dominante pour laquelle plus de quarante gènes ont été mis en cause. Il a été identifié une protéine (une ligase du protéasome) impliquée dans la nécessaire dégradation des protéines de la cellule qui est absente dans l'une des multiples formes de la maladie Parkinson. Néanmoins cette découverte ne permet pas de prévoir dans quel délai il sera possible de guérir la maladie. La compréhension d'une mutation et l'identification de la protéine anormale permettent d'attaquer la maladie sur un point précis mais chaque protéine a de multiples partenaires, ce qui rend la recherche encore plus difficile.

La biologie cellulaire envisage de modifier de manière spécifique le comportement de certaines cellules. Cependant les cellules malades ne représentent qu'une fraction de l'ensemble de l'organisme, et il est difficile de trouver des animaux mimant exactement les pathologies. Dans le cas de la maladie de Parkinson, les patients sont par exemple traités avec de la dopamine, ce qui permet de rétablir la transmission dopaminergique des cellules atteintes. D'autres médicaments comme les anxiolytiques ou les neuroleptiques modifient de manière connue le fonctionnement de certains neurones assez spécifiquement. Des thérapies utilisant des facteurs trophiques sont à l'étude. Ces substances produites naturellement au cours du développement du système nerveux favorisent la repousse neuronale.

La thérapie génique a pour objectif de travailler directement au niveau des gènes. L'idée est de remplacer le gène défectueux, in ou ex vivo. Dans le premier cas, l'objectif est de greffer le gène normal sur un vecteur particulier introduit dans le cerveau pour que l'échange de gènes se produise. Dans le second cas, il s'agit de modifier des cellules en culture et de les greffer par la suite. La thérapie cellulaire est envisagée de la même manière, dans l'optique de greffer de nouvelles cellules. L'ARN interférent a pour but d'agir sur l'intermédiaire entre le gène et la protéine
Ces concepts sont très intéressants sur le plan théorique, mais le cerveau est contrairement à beaucoup d'autres organes composé de tant de cellules différentes, dont on connaît mal les interactions, qu'il est chimérique de vouloir passer trop vite de la boite de Petri à l'homme.
La recherche scientifique doit concilier beaucoup d'impératifs à commencer par assurer une synergie entre des recherches cognitives et appliquées. La société a besoin, entre autre, de recherche finalisée, et il faut en même temps assurer la liberté de créer et la rentabilité industrielle. C'est le défi de l'interaction entre recherche fondamentale et recherche clinique. La recherche en neurosciences pose en outre des problèmes particuliers. Toutes ces études sont chères, et cela soulève des questions morales à l'échelle mondiale lorsque l'on sait que la tuberculose, le paludisme et le sida tuent par millions dans les pays en voie de développement. Dans les pays développés, les associations contre les maladies rares sont très puissantes, et trouvent beaucoup d'argent sur des sujets très spécifiques. Ainsi le budget de fonctionnement du Téléthon est supérieur à celui de l'INSERM ! Pour finir, la recherche sur le cerveau pose naturellement des problèmes éthiques considérables.

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Allèle

Un allèle (abréviation d'allélomorphe) est une version variable d'un même gène, c'est-à dire une forme variée qui peut être distinguée par des variations de sa séquence nucléotidique. En général, il existe deux allèles pour chaque gène, mais certains gènes (par exemple ceux du CMH) possèdent plusieurs dizaines d'allèles. Les allèles d'une paire de chromosomes homologues peuvent être identiques, c'est l'homozygotie, ou différents, c'est l'hétérozygotie.
C'est ainsi qu'au sein d'une même espèce, le génome d'un individu est différent de celui d'un autre individu, c'est le polymorphisme génétique. Ce polymorphisme est également dû à l'apparition de mutations qui sont des variations de la séquence nucléotidique. Il peut donc exister dans les populations naturelles plusieurs séquences différentes d'ADN pour un même locus.

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Utiliser un virus pour parasiter autrui

J-M. Drezen, M. Poirié, Y. Bigot et G. Periquet dans mensuel 296
daté mars 1997

De très nombreux insectes, et notamment certaines guêpes, ont développé des stratégies parasitaires élaborées aux dépens d'autres insectes, particulièrement les papillons. Pour contourner la défense immunitaire de leurs hôtes, ils ont mis au point des procédés permettant de manipuler la physiologie de l'hôte. Beaucoup de ces procédés recourent Ñ situation exceptionnelle dans le monde animal Ñ à des virus, dans de véritables symbioses. Le parasitisme prend ainsi une forme à trois étages où seul l'hôte est perdant. Dans certains cas, les gènes des virus se comportent comme des gènes de la guêpe parasite, qu'elle transmet à ses descendants. Il reste à expliquer quels scénarios évolutifs ont pu conduire à ces associations extraordinaires.

Dans le film fantastique Alien de Ridley Scott, les héros sont décimés par des créatures extraterrestres monstrueuses dont les larves détruisent en quelques jours le corps humain. Ce type d'aventure est monnaie courante sur Terre sous forme de relations hôte-parasite agressives, mais fort heureusement elles restent limitées au monde des invertébrés et en particulier à celui des insectes. Parmi ceux-ci, l'ordre des hyménoptères qui compte plus de 300 000 espèces dont les abeilles, les guêpes et les fourmis a particulièrement développé les stratégies parasitaires puisque la moitié des familles qui le constituent comprennent exclusivement des espèces parasites. Comment s'établissent les relations entre les insectes hôtes et les hyménoptères qui les parasitent, et comment évoluent-elles ?
Les hyménoptères « endoparasites » sont des guêpes qui effectuent la totalité de leur développement embryonnaire et larvaire à l'intérieur du corps d'autres insectes, qu'elles utilisent comme réserve de nourriture. Ce type de stratégie a été très productif sur le plan évolutif, puisque plusieurs dizaines de milliers d'espèces sont répertoriées dans ce groupe. Ces espèces parasitent à peu près toutes les familles d'insectes, souvent de manière étroitement spécialisée, c'est-à-dire qu'elles ne parasitent qu'une espèce particulière. Des individus aussi petits que les pucerons ou aussi difficiles à atteindre que les larves d'insectes xylophages vivant à l'intérieur du bois, sont victimes d'hyménoptères endoparasites spécialisés. Cependant, de nombreux hôtes parasités appartiennent à l'ordre des lépidoptères les papillons et les relations entre lépidoptère hôte et hyménoptère parasite sont de loin les plus étudiées.
Pour un endoparasite, le corps de l'hôte constitue un garde-manger qu'il doit maintenir en bon état de conservation jusqu'à la fin de son propre développement. Cependant, il est aussi un environnement hostile. En effet, l'existence chez les insectes d'un système immunitaire complexe ne fait aujourd'hui plus aucun doute1. Les oeufs du parasite doivent donc échapper aux mécanismes de défense de l'hôte et notamment à l' « encapsulation » formation d'une capsule autour de l'oeuf empêchant son développement. Pour parvenir à ce résultat, les hyménoptères endoparasites ont développé des procédés de manipulation de la physiologie de leur hôte. D'un point de vue évolutif, l'originalité de certains de ces procédés est qu'ils font intervenir des particules virales. Nous allons comparer plusieurs exemples de ces relations à trois partenaires, hôte, parasite et virus.
Pour pondre, les guêpes endoparasites utilisent leur tarière, une longue aiguille creuse située à l'extrémité de l'abdomen, qui perce la cuticule de l'hôte sans l'endommager. Les oeufs sont alors expulsés sous pression par le canal interne de l'aiguille et parviennent dans les tissus de l'hôte. Le fluide génital, liquide qui permet notamment l'expulsion des oeufs, est également injecté. Il s'agit d'une sécrétion complexe contenant un cocktail de substances qui jouent un rôle dans la suppression de la réponse immunitaire de l'hôte, la perturbation de son développement et la modification de son comportement2.

Ces substances peuvent être classées en trois catégories suivant leur origine. Elles comprennent des « venins » produits par des glandes qui déversent leur contenu dans le tractus génital, des protéines à action immunosuppressive sécrétées par l'épithélium ovarien, et enfin des virus qui participent à la modification de la physiologie de l'hôte.
La description de l'influence exercée par les différents facteurs provenant du parasite sur la régulation de l'hôte pourrait faire l'objet à elle seule de plusieurs articles. Nous nous limiterons ici à l'aspect le plus original de ces interactions hôte-parasite, le rôle des facteurs viraux. En effet, la présence chez l'hyménoptère de particules virales injectées lors du parasitisme peut prendre la forme d'une asso-ciation guêpe-virus plus ou moins étroite pouvant aller jusqu'à la symbiose. Ces relations guêpe-virus sont le seul exemple connu où l'évolution a conduit à une association symbiotique entre un virus et un organisme eucaryote. La présence de particules virales a été mise en évidence par microscopie électronique dans le tractus génital de nombreuses espèces d'hyménoptères endoparasites ou dans les glandes à venin qui y débouchent. Dans plusieurs cas, il a pu être montré que ces particules se répliquent en fait dans un épithélium spécialisé des ovaires. Les virus identifiés appartiennent à différents groupes et n'induisent généralement pas de pathologie perceptible chez l'hyménoptère3. La présence de virus dans l'appareil génital des hyménoptères femelles trouve probablement son origine dans le comportement de ces dernières. En effet, en piquant leur tarière dans un hôte infecté, pour pondre ou pour s'alimenter, elles peuvent être contaminées et transmettre le virus aux insectes piqués par la suite. Les virus trouvent un avantage à pouvoir se maintenir ou même se multiplier dans le tractus génital des hyménoptères puisqu'ils peuvent ainsi maximiser le nombre d'hôtes infectés.
Il existe une catégorie de virus, les ascovirus virus à ADN, pour laquelle l'utilisation des hyménoptères comme vecteurs constitue probablement la principale voie de transmission dans les populations d'insectes. Ces virus, découverts par le groupe de Brian Federici à l'université de Riverside, en Californie, sont létaux pour les larves des lépidoptères qu'ils infectent. Le virus dissout les tissus de l'insecte en un liquide d'aspect laiteux tout à fait caractéristique de cette pathologie4.

Contrairement à d'autres virus d'insectes, les ascovirus sont peu infectieux par ingestion, ce qui montre que ce n'est pas leur voie naturelle d'infection. Cependant, ils se montrent très infectieux s'ils sont introduits directement dans la chenille à l'aide d'une aiguille préalablement contaminée. Cela suggère que les ascovirus utilisent des insectes piqueurs en tant que principal mode de dissémination dans les populations de papillons. De fait, les chenilles infectées par un ascovirus sont le plus souvent également parasitées par un hyménoptère. Les ascovirus n'induisent pas de pathologie visible chez les guêpes qui leur servent de vecteurs. Par contre, l'infection d'une chenille hôte entraîne indirectement la mort de la larve du parasite. En effet lorsqu'un hyménoptère parasite une chenille, le virus injecté élimine le papillon infecté et, par contrecoup, la descendance du parasite vecteur. Cependant, dans certaines espèces, le parasite a trouvé le moyen de s'accommoder de l'infection virale : le système a évolué vers un état d'association stabilisée.

Il en est ainsi pour l'un des modèles biologiques que nous étudions, une guêpe nommée Diadromus pulchellus qui parasite la chrysalide d'un lépidoptère, la teigne du poireau. Cette guêpe héberge un ascovirus qui est systématiquement injecté dans l'hôte lors de la ponte. Le virus se maintient dans les tissus de l'hyménoptère mais n'y est pas produit en grande quantité. Il ne se montre pas pathogène pour cette espèce. En revanche, après son injection dans la chrysalide hôte, l'ascovirus entraîne la Iyse destruction des cellules de ses différents tissus. La caractéristique intéressante de ce modèle est la suivante : lorsque le virus est injecté avec l'oeuf du parasite, la Iyse des tissus de la chrysalide se produit beaucoup plus lentement que si le virus est introduit seul, à l'aide d'une aiguille contaminée. Ce délai permet à la larve du parasite de consommer les tissus de l'hôte avant leur désagrégation totale et d'achever ainsi son développement. L'ascovirus élimine donc l'hôte mais non la descendance de l'hyménoptère vecteur. Ces observations montrent que Diadromus pulchellus a développé, au cours de l'évolution, des mécanismes permettant de ralentir le cycle du virus dans l'hôte. Il peut ainsi utiliser à son profit la lyse des tissus de l'hôte induite par l'ascovirus. De son côté, l'ascovirus n'est pas perdant. Il a en effet avantage à être véhiculé par la guêpe pour infecter le plus grand nombre de chrysalides possibles. De fait, tous les individus des populations de Diadromus hébergent des ascovirus. La modification de la durée du cycle viral dans la chrysalide de papillon parasité est donc due à des mécanismes qui ont pu être sélectionnés chez la guêpe pour permettre son développement larvaire dans l'hôte en présence de l'infection virale, mais également chez le virus lui-même pour éviter la disparition de la population d'hyménoptères vecteurs.
Cette association Diadromus ascovirus pourrait en fait être plus étroite qu'il n'y paraît. Comme cela a été décrit pour d'autres systèmes biologiques, la présence du virus pourrait également permettre à la guêpe de contourner les défenses immunitaires de l'hôte en perturbant sa physiologie par le biais de l'infection. Cependant, il est difficile de tester l'existence de cet avantage conféré à la guêpe par l'ascovirus car le génome viral Ñ une molécule d'ADN circulaire de 150 kilobases Ñ se trouve dans toutes les cellules des guêpes des deux sexes et l'on ne peut donc évaluer le succès parasitaire en l'absence de virus. En conclusion, nous observons ici une étape importante dans l'évolution de l'association virus-hyménoptère mais il est clair que l'on n'est pas en présence d'une symbiose. L'ascovirus a conservé son autonomie et peut se transmettre en utilisant occasionnellement les individus d'autres espèces d'hyménoptères. Il se comporte alors comme un ascovirus « classique » entraînant l'échec du parasitisme.
Plusieurs espèces de guêpes ont développé des associations avec des virus plus étroites encore que celle décrite ci-avant. Le virus y perd toute autonomie et a été transformé en une véritable arme de combat biologique, utilisée par la guêpe pour modifier la physiologie de l'hôte. Ces entités virales très particulières ont été découvertes par le groupe de Donald Stoltz de l'université d'Halifax, au Canada, et sont nommées « polydnavirus », en référence à leur génome, qui est composé de plusieurs dizaines de molécules circulaires d'ADN double brin. Tous les polydnavirus identifiés à l'heure actuelle sont associés à des espèces appartenant à deux familles apparentées d'hyménoptères : les ichneumonidés et les braconidés.

Dans le cas du parasitisme d'un papillon, le sphinx du tabac Manduca sexta, par la guêpe Cotesia congregata, modèle que nous étudions en collaboration avec le groupe de Nancy Beckage de l'université de Californie, les particules virales sont produites dans la guêpe par des cellules spécialisées situées à la base de l'ovaire, dans un renflement appelé le calice. Puis les virus sont libérés dans la lumière de l'ovaire, en quantité très importante. Lors de la ponte, les virus présents dans le fluide génital sont injectés dans le corps de l'hôte. Le génome viral pénètre ensuite dans de nombreux types cellulaires et en particulier les plasmatocytes, cellules immunitaires de l'hémolymphe. Les protéines virales sont alors produites en quantité considérable. Par exemple, la protéine virale majeure, EP1, atteint 5 % du total des protéines de l'hémolymphe de l'hôte quarante-huit heures après l'introduction du virus5. Cependant, ce début de cycle viral, qui devrait se poursuivre par la réplication de l'ADN du virus, avorte et il n'y a pas production de nouveaux virus. Les polydnavirus sont donc totalement dépendants de l'hyménoptère pour leur multiplication.
La présence de ces virus est également capitale pour l'hyménoptère. En effet, il a été démontré expérimentalement que les polydnavirus sont nécessaires au succès du parasitisme, ceci aussi bien pour l'espèce de guêpe que nous étudions famille des braconidés que pour une espèce de la famille voisine des ichneumonidés.
L'introduction artificielle des oeufs du parasite dans l'hôte en l'absence de fluide génital conduit à leur destruction. En revanche, lorsque les oeufs sont introduits avec du virus purifié injecté en solution, ils se développent normalement. Par ailleurs, si le génome viral a été détruit par rayonnement ultraviolet, les particules infectées ne confèrent plus aucune action protectrice aux oeufs du parasite6. Ce n'est donc pas la simple présence des particules virales dans l'hôte qui est nécessaire à la survie et au développement du parasite, mais bien l'expression des gènes viraux.

De manière encore plus remarquable, l'association guêpe-polydnavirus va au-delà de la dépendance physiologique. Il a en effet été montré que le génome viral présent dans le noyau des cellules de l'hyménoptère ne s'y trouve pas uniquement sous forme de molécules circulaires d'ADN viral, mais également sous forme intégrée dans une structure génomique de grande taille qui correspond, selon plusieurs auteurs, à un chromosome de la guêpe. C'est à partir de cette matrice que sont fabriqués les cercles d'ADN viral. Ce phénomène a été mis en évidence dans deux espèces de la famille des Ichneumonidés7. Nos résultats montrent que cette forme intégrée du génome viral existe également pour un polydnavirus associé à l'hyménoptère braconidé Cotesia Congregata. Les gènes intégrés des polydnavirus se comportent en fait comme de véritables gènes de la guêpe, transmis verticalement à ses descendants. La présence du polydnavirus est indispensable à la réussite parasitaire de la guêpe et le virus, de son côté, ne peut se multiplier que dans l'hyménoptère. Ces deux partenaires ont ainsi constitué une association de type symbiotique, stabilisée grâce à l'intégration de l'ADN viral dans le génome de l'hyménoptère.
Pour comprendre l'action des polydnavirus dans l'hôte, il faut rappeler qu'il existe chez les insectes un mécanisme permettant d'éliminer un corps étranger, comme par exemple l'oeuf d'un parasite. Ce mécanisme consiste dans un premier temps à isoler ce corps étranger en l'entourant d'une « capsule », généralement composée de cellules immunitaires et d'une substance synthétisée par l'organisme, la mélanine. L'« encapsulation » est un phénomène complexe et encore mal connu. Chez les lépidoptères, la première étape de la formation d'une capsule est la reconnaissance de l'oeuf du parasite par les granulocytes, cellules qui contiennent des inclusions dans leur cytoplasme. Cette reconnaissance entraîne leur dégranulation, c'est-à-dire la libération de leurs inclusions et des médiateurs chimiques qu'elles contiennent. Les facteurs libérés vont attirer les plasmatocytes qui vont entourer le corps étranger pour former la capsule8.

Les polydnavirus sont capables d'inhiber ce mécanisme d'encapsulation9. Il a en effet été montré que l'injection de polydnavirus purifié provoque très rapidement une modification des capacités d'adhésion des plasmatocytes. Ces cellules ne sont alors plus capables de s'attacher sur un corps étranger et ne forment pas de capsule. D'autre part, non contents d'altérer ces fonctions, les polydnavirus induisent un phénomène de mort cellulaire massive des cellules immunitaires de l'hôte. Ce phénomène, décrit par le groupe de Michael Strand de l'université du Wisconsin, concerne particulièrement les granulocytes dont le nombre baisse considérablement dans les jours qui suivent la ponte du parasite. Ces cellules sont détruites par l'activation de leurs propres gènes d'apoptose, c'est-à-dire les gènes déclenchant la mort cellulaire programmée. Notre connaissance actuelle permet d'imaginer des scénarios expliquant l'évolution des interactions guêpes-virus vers une symbiose du type hyménoptère polydnavirus. Nous avons vu que les hyménoptères parasites sont des outils de dissémination des virus dans les populations d'insectes hôtes. Ce phénomène favorise l'apparition d'associations hyménoptère virus, qui peuvent être stabilisées si le virus ne défavorise pas le parasite en ayant un effet pathogène ou en empêchant le développement de la larve dans l'hôte. Par exemple, dans le modèle Diadromus ascovirus , des mécanismes entraînant le ralentissement du cycle viral de l'ascovirus dans lachrysalide parasitée et donc permettant le développement du parasite, ont été sélectionnés. Ceci a permis de stabiliser l'association guêpe ascovirus : comme nous l'avons montré, dans les populations naturelles d'hyménoptères, tous les individus hébergent cet ascovirus. Cette observation suggère que l'association est également bénéfique pour la guêpe. Si le virus devient non plus avantageux mais indispensable à la réussite parasitaire de l'hyménoptère, on peut observer l'apparition d'associations de type symbioses. Dans le cas des polydnavirus, nous pouvons imaginer plusieurs scénarios évolutifs différents.
Dans une première hypothèse, un virus infecte, à l'origine, une espèce de lépidoptère parasitée par un hyménoptère : il effectue son cycle viral complet chez le papillon et se maintient chez la guêpe. Ce virus est avantageux pour l'hyménoptère en favorisant sa réussite parasitaire. A un moment donné, le matériel génétique viral s'intègre dans le génome d'une cellule germinale ou d'un oeuf du parasite. Il est alors transmis à la descendance de cette guêpe. Cette association irréversible étant avantageuse pour l'hyménoptère, elle se fixe dans la population. Sous l'effet de la sélection, le virus peut alors perdre progressivement sa capacité à effectuer un cycle complet dans l'hôte puisque la production de particules infectieuses n'est plus nécessaire à sa transmission. De même, le parasite peut perdre sa capacité à « réussir » le parasitisme en l'absence de virus.

A terme, seules seront conservées chez le virus les fonctions utiles à la réussite parasitaire, c'est-à-dire la réplication des gènes codant pour les protéines à action immunosuppressive et la production des particules permettant de les transporter dans les cellules de l'hôte. Le virus est alors devenu une véritable « sécrétion génétique » du parasite. En poussant ce raisonnement à l'extrême, le génome viral présent dans les particules peut même finir par disparaître si ces dernières sont à elles seules suffisantes à conférer l'avantage sélectif au parasite. Cette situation a été décrite pour une guêpe ichneumo-nidée, Venturia canescens, qui produit des VLP Virus like particule, c'est-à-dire des particules virales sans matériel génétique. Les VLP recouvrent les oeufs du parasite et assurent son camouflage vis-à-vis des mécanismes de défense de l'hôte, permettant ainsi le succès parasitaire10.
Une autre hypothèse pouvant expliquer la mise en place de ces symbioses suppose l'existence d'un virus effectuant son cycle viral chez l'hyménoptère. Ce virus peut être quelque peu pathogène pour la guêpe mais il améliore la réussite parasitaire lorsqu'il est injecté dans l'hôte parasité en même temps que l'oeuf. A la suite de l'intégration exceptionnelle de l'ADN viral dans la lignée germinale de la guêpe, l'association devient irréversible. La sélection peut alors conduire à la perte des gènes viraux dont l'expression constituait un désavantage pour l'hyménoptère ; le virus perd son caractère pathogène pour la guêpe. La production de grandes quantités de virus dans les cellules du tractus génital de la guêpe est en revanche sélectionnée puisqu'elle présente un avantage lors du parasitisme. En faveur de cette hypothèse d'une origine hyménoptère des polydnavirus, il faut noter que des cercles d'ADN viraux sont produits en faible quantité dans tous les tissus de la guêpe. Cette faible production virale pourrait être le reflet d'une multiplication ancestrale ubiquiste du virus. Comme dans le premier scénario, le parasite peut alors perdre sa capacité à réussir le parasitisme en l'absence de virus.
Ces observations soulignent le caractère original des associations mises en place dans le groupe des hyménoptères. Ainsi, elles montrent que les virus qui utilisent leur hôte pour se multiplier peuvent parfois être eux-mêmes utilisés par l'organisme qui les abrite. Dans le cas extrême des polydnavirus, cette évolution a conduit à la mise en place d'une symbiose. Dans les années à venir, la poursuite des travaux sur d'autres modèles biologiques et l'obtention d'une meilleure connaissance des phylogénies des hyménoptères et de leurs virus permettront de tester et d'améliorer les scénarios évolutifs de mise en place de ces associations. Ces tra- vaux permettront également d'expliquer comment, non contents d'avoir inventé la vie en société, les hyménoptères ont également réussi à mettre au point l'arme biologique.

1 J.A. Hoffman, « Innate imunity of insects », Current Opinion in Immunology, 7 , 1995.
2 N.E. Beckage, Parasites and pathogens of insects , vol. 1, Academic Press Inc, San Diego, 1993.
3 D. Stoltz et J.B. Whitfield, Journal of Hymenopteran Research , 1 , 125, 1992.
4 B.A. Federici, P NAS , 80 , 7664, 1983.
5 S. Harwood et al. , Journal of Virology , 205 , 381, 1994.
6 K.M. Edson et al. , Science , 211 , 582, 1981.
7 J.G. W. Fleming et al. , in « Parasites and pathogens of insects » , vol 1, Academic Press Inc, San Diego,1993.
8 M.D. Summers et S.D. Dib-Hajj., P NAS , 92 , 29, 1995.
9 M.R. Strand et al. , Annual Review of Entomology, 40 , 31, 1995.
10 I. Feddersen et al. , Experientia , 42 , 1278, 1986.

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La transgènese sansl'aide des virus?
mensuel 315
daté décembre 1998 -

Les vecteurs synthétiques ont plusieurs atouts. Leur production est simple et sûre, ils sont stables et peuvent contenir des constructions génétiques de grande taille. Construits de toutes pièces, ces vecteurs s'inscrivent dans une perspective de gène-médicament. Mais si leur efficacité in vitro est satisfaisante, les résultats in vivo sont décevants, sans doute parce que la connaissance des mécanismes impliqués reste insuffisante. Quelques études cliniques ont été lancées pour une utilisation locale.
Les virus possèdent la capacité d'atteindre leur cellule cible, d'y pénétrer et d'y exprimer leur matériel génétique. S'en servir comme système de délivrance de gènes thérapeu- tiques oblige, pour des raisons de sécurité, à les modifier de telle sorte qu'ils deviennent incapables de se multiplier. D'objets vivants dont la finalité est le transfert de gènes à des fins de reproduction, dérivent des éléments tout aussi invasifs, mais stériles : des vecteurs viraux dits défectifs. Or, la biologie de ces derniers s'éloigne parfois considérablement de celle du virus d'origine : ils perdent certaines propriétés, et peuvent même en acquérir de néfastes. C'est donc logiquement qu'a surgi l'idée de créer des vecteurs purement chimiques, dans lesquels les éléments fondamentaux de la stratégie virale sont remplacés par des composants de synthèse. Pour l'industrie pharmaceutique, l'irruption de la synthèse chimique dans le champ de la vectorologie a le double avantage de valoriser son savoir-faire traditionnel, en chimie et dans les systèmes de délivrance de médicaments, et de lui permettre de s'affranchir des lourdes contraintes liées à la fabrication de vecteurs viraux.
Aujourd'hui, les chercheurs disposent d'une multitude de réactifs de transfection, à base de polymères ou de lipides, vendus par des sociétés privées Gibco, Promega, Boehringer-Mannheim.... Plutôt que de développer de nouveaux vecteurs, ils essaient de modifier le plus simplement possible les transporteurs du commerce : les particules renfermant l'ADN doivent s'associer aux cellules cibles, pénétrer dans leur cytoplasme, et enfin délivrer leur contenu dans le noyau cellulaire.

Déroulé, un petit gène, une molécule d'ADN de quelques dizaines de milliers de paires de bases, est d'une longueur comparable à celle d'une cellule. Difficile pour le premier de pénétrer la seconde. D'autre part, l'ADN est une molécule chargée négativement. Les virus compactent fortement l'ADN, grâce à des protéines riches en acides aminés chargés positivement, les histones. Voilà pourquoi la plupart des vecteurs de synthèse sont des lipides, des peptides ou des polymères chargés positivement, dits cationiques. Comme les histones, ils peuvent à la fois condenser l'ADN et donner une charge positive à l'ensemble. Cet excès de charges positives permet aux transporteurs cationiques d'interagir, par l'intermédiaire de liaisons électrostatiques, avec les charges négatives présentées par la membrane cellulaire.
Quelle que soit la nature du vecteur, les interactions de l'ADN avec celui-ci restent imprédictibles. La plupart des équipes mélangent de manière empirique vecteur et acide nucléique : il se forme un complexe qui contient, en général, plusieurs molécules d'ADN. De plus, ces complexes vecteur cationique/ADN ont tendance à s'agréger. Observés au microscope électronique, les complexes ont un diamètre de 50 à 150 nanomètres1. Seule une condensation contrôlée de l'ADN permettrait la formation de particules ne renfermant qu'une seule molécule d'ADN1. Cela réduirait leur diamètre à une vingtaine de nanomètres, facilitant considérablement le franchissement des compartiments vasculaires, ainsi que la pénétration dans les cellules et leur noyau. Notons par ailleurs que le fait que l'ADN soit compacté le protège des enzymes capables de le dégrader, les nucléases.
Comment faire entrer les complexes transfectants* dans les cellules ? Avant de pénétrer dans une cellule, certains virus interagissent avec des protéines sucrées anioniques, c'est-à-dire chargées négativement, qui sont présentes sur la membrane plasmique. De même, lorsque les complexes transfectants ont une charge nette positive, il semble qu'ils utilisent ces molécules de surface pour se fixer sur la cellule2. Ces interactions électrostatiques leur permettent ensuite d'y pénétrer. In vitro , l'étape de pénétration dans la cellule ne pose pas de problème. Les molécules du commerce sont extrêmement efficaces sur les cultures cellulaires : le taux de transfection des cellules approche parfois les 100 %. Cependant, in vivo , leur efficacité chute considérablement pour souvent tomber quasiment à zéro. Ainsi, après injection par voie intra- veineuse des complexes chargés positivement, on constate que le transfert de gènes s'effectue surtout vers les cellules des poumons et du foie. Cette biodis-tribution suggère que les complexes transfectants s'agrègent en particules de grande taille, car ils interagissent sans doute avec des protéines du sang. Ils ne peuvent donc pas quitter de manière efficace le système vasculaire : les particules sont mécaniquement retenues par les filtres naturels que constituent les poumons et le foie et pénè- trent dans les premières cellules qu'elles y rencontrent.
Une fois franchi les premiers filtres physiologiques, on cherchera le plus souvent à éviter la dissémination de l'ADN thérapeutique dans l'ensemble de l'organisme : il faut le conduire vers des cibles spécifiques. Pour cela - tout comme dans le cas des vecteurs viraux - on peut greffer sur le transporteur des ligands*, molécules qui seront reconnues par les récepteurs présents sur le type cellulaire choisi3. Ces ligands peuvent être très variés sucres, peptides, hormones.... Ils ont pour intérêt de substituer une interaction transporteur/cellule très spécifique, à celle non spécifique due aux charges ioniques. Par exemple, des protéines sucrées complexes, les asialoglycoprotéines, permettent une entrée dirigée vers les cellules du foie4.
Les cellules absorbent les éléments du milieu extérieur par endocytose : leur membrane se replie jusqu'à former une vésicule, l'endosome. Les complexes de transfection profitent de ce mécanisme pour pénétrer leurs cibles cellulaires. L'intérieur de l'endosome s'acidifie progressivement, puis fusionne avec une autre sorte de vésicule, appelée lysosome.
Ce dernier contient des enzymes qui dégradent son contenu. Une fois dans l'endosome, les complexes doivent donc absolument s'en échapper avant d'être déversés dans les lysosomes et de subir leur attaque enzymatique. On associe donc aux vecteurs synthé- tiques des molécules, dites fusiogè- nes, qui déstabilisent les membranes de l'endosome, et leur permettent de s'évader. Afin que l'activité fusiogène ne se révèle qu'après l'entrée dans l'endosome, on choisit des molécules dont l'activité ne s'exerce que lorsque le milieu s'acidifie. Les vecteurs lipidiques sont ainsi associés à un lipide particulier surnommé DOPE pour di-oleoyl-phosphatidyl-éthanolamine. Les autres types de vecteurs - peptidiques, polymériques... - peuvent être associés à des peptides fusiogènes. L'un d'entre eux provient du virus de la grippe et permet d'augmenter d'environ cent fois l'efficacité de la transfection5.
On peut aussi utiliser des particules virales, telles que les adénovirus, qui ont élaboré des mécanismes efficaces pour échapper à la dégradation intracellulaire. En utilisant des adénovirus défectifs* associés avec des complexes de transfert, l'efficacité du transfert de gène peut être multipliée par un facteur 1 0006. Mais l'avantage du tout synthétique est alors perdu.
Une fois dans le cytoplasme, encore faut-il que l'ADN atteigne le noyau de la cellule. Introduit dans des cellules en croissance en particulier des cellules en culture, l'ADN pénètre dans le noyau au cours de la division cellulaire, lorsque l'enveloppe nucléaire est disloquée. Mais dans les cellules au repos - état dans lequel se trouve la majorité des cellules de l'organisme - l'enveloppe nucléaire constitue une barrière qui ne laisse passer, par diffusion, que les molécules de diamètre inférieur à 9 nm. Les molécules dont la taille est comprise entre 9 et 25 nm, peuvent pénétrer dans le noyau en empruntant les pores de la membrane nucléaire. Il s'agit alors d'un transport actif qui nécessite la reconnaissance de signaux particuliers appelés signaux de localisation nucléaire ou NLS7. Mais la greffe d'un tel signal sur un vecteur synthétique n'a pas amélioré l'efficacité de la transfection8. De plus, rappelons que la plupart des complexes de transfert mesurent plus de 25 nm. Cette étape du transport nucléaire est aujourd'hui la plus difficile à résoudre. Elle fait d'ailleurs l'objet de nombreux travaux.

Autre problème, si le vecteur devait rester associé à l'ADN jusque dans le noyau, il faut s'assurer que sa présence n'interfère pas avec la transcription du gène introduit. Ainsi, des complexes à base de polymères des polyéthylènimines, par exemple, inhibent peu ou pas la transcription du transgène9. En revanche, les transporteurs cationiques à base de lipides inhibent cette transcription, lorsqu'ils présentent un excès de charges positives.
Au-delà des problèmes de vectorisation de l'ADN dans les cellules cibles, d'autres éléments se révèlent cruciaux, comme le maintien durable du gène thérapeutique dans les cellules - nécessaire si l'on souhaite traiter une maladie génétique - et la régulation de son expression selon les besoins de l'organisme. Pour s'assurer du maintien du gène, une première solution, efficace, est l'intégration du transgène au génome de l'hôte. Dans l'idéal, cette intégration devrait être ciblée, ce qu'on est encore loin de savoir réaliser. En effet, une intégration au hasard dans le chromosome, peut se faire au milieu d'un autre gène, et l'inactiver. Une autre voie de recherche est de maintenir la construction génétique, le plasmide, sous forme dite épisomale : arrivée au noyau mais non intrégrée au génome de l'hôte, elle se répliquera au cours des divisions de la cellule. Pour y parvenir, les chercheurs emploient des systèmes développés par des virus tels que celui d'Epstein-Barr. Enfin, troisième possibilité, l'introduction dans la cellule cible de mini-chromosomes artificiels MAC en anglais, stables et se répliquant aussi de manière autonome10.

Dans ce dernier cas, le gène pourrait être transféré avec tous ses sites de régulation, qui peuvent parfois s'étendre sur plusieurs fois la longueur du gène. Son expression serait alors contrôlée par la cellule de façon naturelle. C'est là un atout potentiel majeur des vecteurs synthétiques : il n'y a quasiment pas de limite à la taille de l'ADN transfecté. Si les vecteurs viraux ne peuvent pas dépasser la trentaine de kilobases, leurs homologues synthétiques peuvent tout à fait transfecter plus de 400 kb in vitro et donc un gène, accompagné de toutes ses séquences de régulation11.
A l'heure actuelle, l'intérêt des systèmes non viraux réside essentiellement dans la simplicité de leur préparation, leur stabilité et leur pureté. Leur nature chimique implique que les chercheurs contrôlent bien la structure des transporteurs, du moins avant qu'ils soient associés à l'ADN. A terme, ils seront peut-être intéressants pour une utilisation locale, par exemple par instillation dans les poumons pour soigner la mucoviscidose. En effet, dans ce cas, on estime qu'il suffit de transfecter 5 % des cellules du poumon pour améliorer l'état des malades. Des essais en phase I sont d'ailleurs en cours. La faible efficacité du transfert et son aspect transitoire sont aussi moins gênants en cancérologie : de nombreuses injections intratumorales ont également été tentées. Cependant, le fossé qui sépare les résultats in vitro et in vivo montre les limites du modèle expérimental de cellules en culture dans le cadre de la thérapie génique.

1 F. Labat-Moleur et al ., Gene Ther ., 3 , 1010, 1996.
2 K.A. Mislick et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 93 , 12349, 1996.
3 J.C. Perales et al ., Eur. J. Biochem. , 226 , 255, 1994.
4G.Y. Wu et al., J. Biol. Chem., 262 , 4429, 1987.
5 C. Plank et al ., J. Biol. Chem. , 269 , 12918, 1994.
6 D.T. Curiel et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 88 , 8850, 1991.
7 C. Dingwall et al ., Trends Biochem. Sci. , 16 , 478, 1991.
8 J.S. Remy et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 92 , 1744, 1995.
9 H. Pollard et al. , J. Biol. Chem. , 273 , 7507, 1998.
10 J.M. Vos, Curr. Opin. Genet. Dev ., 8 , 351, 1998.
11 B.T. Lamb et al ., Nature Genetics , 5 , 312, 1993.

NOTES
*TRANSFECTANT
De transfection, une opération de génie génétique consistant à introduire dans des cellules cultivées in vitro des molécules d'ADN étranger, ici grâce à des transporteurs synthétiques.
*LIGAND
Molécule qui se lie à une protéine jouant le rôle de récepteur. C'est par exemple le cas des hormones et des facteurs de croissance.
*ADÉNOVIRUS DÉFECTIF
Les adénovirus sont des virus à ADN. Ils sont dits défectifs, lorsqu'on leur a enlevé certains gènes responsables de leur infectiosité. Ils sont alors incapables d'effectuer leur cycle complet chez l'hôte.

L'ADN NU, MÉTHODE ALTERNATIVE
Face aux difficultés de la technique de transfection par vecteur synthétique, des méthodes alternatives, regroupées sous l'appellation de techniques physiques, sont en développement. C'est le cas de l'injection d'ADN nu, sans vecteur. L'équipe de Jon Wolff de l'université du Wisconsin a été la première à injecter de l'ADN nu directement dans un muscle, en 1990. Et elle a eu des surprises. Là encore, l'efficacité de la transfection est faible : un taux d'expression de protéine, atteignant tout au plus 1 %, ne permet pas de restaurer une fonction défaillante et de traiter, par exemple, la myopathie de Duchenne. Mais, bien que faible, la quantité de protéine produite a déclenché une réaction immunitaire. Cette technique pourrait donc déboucher de manière imprévue sur un nouveau mode de vaccination. Des essais ont été menés chez la souris contre l'herpès, la grippe, l'hépatite B, la malaria. Des entreprises de biotechnologies se sont d'ores et déjà emparées de cette technologie voir l'article de Catherine Ducruet dans ce numéro.

Deux autres techniques permettent d'introduire de l'ADN dans les cellules. Le canon à gènes, méthode appelée biolistique, projette dans les cellules des microbilles sur lesquelles est fixé de l'ADN. Elle est employée pour modifier les cellules végétales, protégées par une paroi rigide que les microbilles perforent. Certains l'envisagent aussi pour la vaccination. Quant à l'électroporation, elle déstabilise les membranes cellulaires au moyen d'une dé-charge électrique. Elle est très efficace in vitro , mais son application in vivo est difficile.

SAVOIR
J.P. Behr, Médecine/Sciences , 12 , 56, 1996.
J.Y. Legendre et al ., Médecine/Sciences , 12 , 1334, 1996.

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